Evidence for a reactive gamma-carboxyl group (Glu-418) at the herbicide glyphosate binding site of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli.
J Biol Chem · 1988 · 263:11631-5 · PMID 2900243 · 등급6 세포·모델 세포실험 · 물질과 작용기전 > EPSPS·시킴산 경로
요약 생성 대기 중입니다.
초록 전문 번역 · gemma4:e4b
5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, 비선택성 제초제 글리포세이트(N-(phosphonomethyl)glycine)의 표적 효소와의 반응을 glycine ethyl ester 존재 하에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide와 함께 배양한 결과, 시간 의존적인 효소 활성 감소가 관찰되었다. 비활성화는 유사 1차 속도론을 따랐으며, pH 5.5 및 25°C에서 2차 반응 속도 상수 값은 $2.2 \text{ M}^{-1} \text{ min}^{-1}$이었다. 이 비활성화 과정은 기질인 shikimate 3-phosphate와 글리포세이트의 조합으로 효소를 사전 배양했을 때 예방되었으나, shikimate 3-phosphate, phosphoenolpyruvate 또는 글리포세이트 단독으로는 예방되지 않았다. 사전 배양 중 글리포세이트 농도를 증가시킬수록 효소 비활성화 속도는 감소하였다. 효소의 완전한 비활성화를 위해서는 효소 분자당 4개의 카르복실기 변형이 필요했다. 그러나 잔류 활성과 변형 정도에 대한 통계적 분석 결과, 4개의 변형 가능한 카르복실기 중 오직 1개만이 활성에 결정적임을 보여주었다. shikimate 3-phosphate와 글리포세이트가 없는 조건에서 역상 크로마토그래피를 통해 변형된 효소에 대한 트립신 매핑 결과, shikimate 3-phosphate와 글리포세이트 존재 하에 변형된 효소에서는 발견되지 않은 [$^{14}\text{C}$]glycine ethyl ester를 포함하는 펩타이드가 분리되었다. 이 표지된 펩타이드의 아미노산 서열 분석을 통해 변형된 결정적 카르복실기는 Glu-418로 확인되었다. 위 결과들은 Glu-418이 이러한 조건 하에서 가장 접근성이 높은 반응성 카르복실기이며 글리포세이트 결합 부위와 위치하거나 근접해 있음을 시사한다.ORIGINAL ABSTRACT
Incubation of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, a target for the nonselective herbicide glyphosate (N-(phosphonomethyl)glycine), with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide in the presence of glycine ethyl ester resulted in a time-dependent loss of enzyme activity. The inactivation followed pseudo-first order kinetics, with a second order rate constant of 2.2 M-1 min-1 at pH 5.5 and 25 degrees C. The inactivation is prevented by preincubation of the enzyme with a combination of the substrate shikimate 3-phosphate plus glyphosate, but not by shikimate 3-phosphate, phosphoenolpyruvate, or glyphosate alone. Increasing the concentration of glyphosate during preincubation resulted in decreasing the rate of inactivation of the enzyme. Complete inactivation of the enzyme required the modification of 4 carboxyl groups per molecule of the enzyme. However, statistical analysis of the residual activity and the extent of modification showed that among the 4 modifiable carboxyl groups, only 1 is critical for activity. Tryptic mapping of the enzyme modified in the absence of shikimate 3-phosphate and glyphosate by reverse phase chromatography resulted in the isolation of a [14C]glycine ethyl ester-containing peptide that was absent in the enzyme modified in the presence of shikimate 3-phosphate and glyphosate. By amino acid sequencing of this labeled peptide, the modified critical carboxyl group was identified as Glu-418. The above results suggest that Glu-418 is the most accessible reactive carboxyl group under these conditions and is located at or close to the glyphosate binding site.| 저자 | Huynh, Q. K. |
|---|---|
| 저널 | The Journal of biological chemistry |
| 권·호·쪽 | 263(24), 11631-5 |
| PMID | 2900243 |
| MeSH | 3-Phosphoshikimate 1-Carboxyvinyltransferase; Alkyl and Aryl Transferases; Amino Acid Sequence; Binding Sites; Chemical Phenomena; Chemistry; Chromatography, High Pressure Liquid; Enzyme Activation; Escherichia coli; Ethyldimethylaminopropyl Carbodiimide; Glutamates; Glutamic Acid; Glycine; Herbicides; Kinetics; Molecular Sequence Data; Shikimic Acid; Transferases; Glyphosate |