Engineering 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthases from Halomonas sp. for Augmenting Glyphosate-Resistance without Activity Penalty.
J Agric Food Chem · 2025 · 73:10430-10438 · PMID 40252030 · 등급6 세포·모델 세포실험 · 물질과 작용기전 > EPSPS·시킴산 경로 · 식물
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글리포세이트는 5-엔올피루빌시키메이트-3-인산 합성효소(EPSPS)를 표적으로 하여 대부분의 초본 식물에 비선택적으로 저해 작용을 한다. 글리포세이트 내성 EPSPS 유전자를 작물에 도입하는 것은 분자 육종에 필수적인 제초제 내성을 부여한다. 본 연구에서는 방향성 진화(directed evolution)를 통해 Halomonas sp.의 EPSPS를 개선하였다. 두 번의 선별 과정을 거친 결과, 네 가지 돌연변이(G112A, M155V, I285F, D326E)를 가진 최적 변이체(HoEPSPS-4M)는 글리포세이트 내성($k_{cat}/K_m \times K_i$)에서 22배 증가와 촉매 효율($k_{cat}/K_m$)에서 2.3배 향상을 보였다. 등온 적정 열량계(ITC) 분석 결과, 글리포세이트 결합 친화도가 1.7배 감소한 것으로 나타났다. 분자 도킹 및 동역학 시뮬레이션은 활성 부위의 G112A 돌연변이가 글리포세이트 결합을 감소시켰으며, 원거리 돌연변이들이 단백질 동역학 및 기능 네트워크를 변화시켜 효소 활성을 조절함을 보여주었다. Nicotiana benthamiana에서 HoEPSPS-4M의 과발현은 높은 글리포세이트 내성을 부여하여 제초제 내성 작물 개발 가능성을 입증하였다. 본 연구는 글리포세이트 내성을 위한 유전적 자원을 확장하고 단백질 공학을 통한 내성 및 효소 효율 최적화에 대한 통찰력을 제공한다.ORIGINAL ABSTRACT
Glyphosate nonselectively inhibits most herbaceous plants by targeting 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS). Introducing glyphosate-resistant EPSPS genes into crops imparts herbicide resistance, essential for molecular breeding. In this study, we enhanced the EPSPS from Halomonas sp. through directed evolution. After two screening rounds, the best variant (HoEPSPS-4M) with four mutations (G112A, M155 V, I285F, D326E) exhibited a 22-fold increase in glyphosate resistance (kcat/Km × Ki) and a 2.3-fold improvement in catalytic efficiency (kcat/Km). Isothermal titration calorimetry (ITC) showed a 1.7-fold reduction in glyphosate binding affinity. Molecular docking and dynamics simulations revealed that the G112A mutation at the active site decreased glyphosate binding, while distal mutations modulated enzymatic activity by altering protein dynamics and functional networks. Overexpression of HoEPSPS-4 M in Nicotiana benthamiana conferred high glyphosate resistance, demonstrating its potential for developing herbicide-resistant crops. This work expands genetic resources for glyphosate resistance and provides insights into optimizing resistance and enzymatic efficiency by protein engineering.| 저자 | He, Y.; Hua, Y.; Chen, X.; Zhang, X.; Lei, L.; Lin, Y.; Wu, G. |
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| 저널 | Journal of agricultural and food chemistry |
| 권·호·쪽 | 73(17), 10430-10438 |
| PMID | 40252030 |
| DOI | 10.1021/acs.jafc.5c00610 |
| MeSH | Glyphosate; Glycine; 3-Phosphoshikimate 1-Carboxyvinyltransferase; Herbicides; Herbicide Resistance; Bacterial Proteins; Halomonas; Molecular Docking Simulation; Protein Engineering; Mutation; Kinetics; Nicotiana |