Reevaluating glyphosate as a transition-state inhibitor of EPSP synthase: identification of an EPSP synthase.EPSP.glyphosate ternary complex.
Biochemistry · 1995 · 34:6433-40 · PMID 7756274 · 등급6 세포·모델 세포실험 · 물질과 작용기전 > EPSPS·시킴산 경로 · 수생생물
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다수의 연구에서 글리포세이트가 EPSP 합성효소와 시키미산 3-인산과 단단한 삼원 복합체를 형성함을 확인하였다. [Anton, D., Hedstrom, L., Fish, S., & Abeles, R. (1983) Biochemistry 22, 5903-5908; Steinrücken, H. C., & Amrhein, N. (1984) Eur. J. Biochem. 143, 351-357]에 따르면 이 복합체에서 글리포세이트는 추정되는 포스포에놀피루보일 산소늄 이온의 전이 상태 유사체로 기능한다고 제안되었다. 이것이 사실이기 위해서는 글리포세이트가 효소 활성 부위 내에서 정상적으로 PEP와, 순환을 통해 생성물인 EPSP의 카르복시비닐 그룹과 연관된 공간을 차지해야 한다. 이 모델에 따르면, 기질로 EPSP와 인산염을 사용하는 역방향 EPSP 합성효소 반응에서는 글리포세이트가 효소 또는 효소-기질 복합체와 거의 상호작용하지 않을 것으로 예측된다. 이러한 예상과는 대조적으로, 신속한 겔 여과 실험은 글리포세이트가 EPSP의 존재 하에 효소에 포획되어 EPSPS·EPSP·글리포세이트의 삼원 복합체를 형성할 수 있다는 직접적인 증거를 제공하였다. 이 복합체의 실험적으로 결정된 화학량론적 비율인 0.62 당 글리포세이트/몰 EPSPS는 EPSPS·S3P·글리포세이트 삼원 복합체에서 발견되는 값(0.66)과 유사하다. 이러한 직접적인 결합 결과는 형광 적정 실험을 통해 확증 및 정량화되었으며, 이 실험에서는 글리포세이트가 효소와 EPSP와 비교적 단단한 ($K_d = 56 \pm 1 \mu M$) 삼원 복합체를 형성하는 것이 입증되었다. 이 발견은 정상 상태 동역학을 통해 추가로 검증되었고 기질 순환에 미치는 영향이 분석되었다. 글리포세이트는 $K_{ii(app)} = 54 \pm 2 \mu M$로 EPSP에 대한 비경쟁적 저해제로 밝혀졌다.ORIGINAL ABSTRACT
Numerous studies have confirmed that glyphosate forms a tight ternary complex with EPSP synthase and shikimate 3-phosphate. It has been proposed [Anton, D., Hedstrom, L., Fish, S., & Abeles, R. (1983) Biochemistry 22, 5903-5908; Steinrücken, H. C., & Amrhein, N. (1984) Eur. J. Biochem. 143, 351-357] that in this complex glyphosate functions as a transition-state analog of the putative phosphoenolpyruvoyl oxonium ion. For this to be true, glyphosate must occupy the space in the enzyme active site that is normally associated with PEP and, through turnover, the carboxyvinyl group of the product EPSP. According to this model, one would predict that, in the reverse EPSP synthase reaction with EPSP and phosphate as substrates, there should be little if any interaction of glyphosate with enzyme or enzyme.substrate complexes. In contrast to this expectation, rapid gel filtration experiments provided direct evidence that glyphosate could be trapped on the enzyme in the presence of EPSP to form a ternary complex of EPSPS.EPSP.glyphosate. The experimentally determined stoichiometry for this complex, 0.62 equiv of glyphosate/mole of EPSPS, is similar to that found for the EPSPS.S3P.glyphosate ternary complex (0.66). This direct binding result was corroborated and quantitated by fluorescence titration experiments which demonstrated that glyphosate forms a reasonably tight (Kd = 56 +/- 1 microM) ternary complex with enzyme and EPSP. This finding was further verified, and its impact on substrate turnover analyzed, by steady-state kinetics. Glyphosate was found to be an uncompetitive inhibitor versus EPSP with Kii(app) = 54 +/- 2 microM.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)| 저자 | Sammons, R. D.; Gruys, K. J.; Anderson, K. S.; Johnson, K. A.; Sikorski, J. A. |
|---|---|
| 저널 | Biochemistry |
| 권·호·쪽 | 34(19), 6433-40 |
| PMID | 7756274 |
| DOI | 10.1021/bi00019a024 |
| MeSH | 3-Phosphoshikimate 1-Carboxyvinyltransferase; Alkyl and Aryl Transferases; Glycine; Kinetics; Macromolecular Substances; Protein Binding; Recombinant Proteins; Transferases; Glyphosate |